母乳是婴儿的主要营养来源，这其中包含了许多营养物质和微生物，它们将有助于发育中婴儿消化系统和免疫系统的成熟。一般健康女性母乳中菌群数目约为103至104 CFU/mL，从中可以分离得到葡萄球菌、链球菌、肠球菌、乳杆菌和双歧杆菌等，其中一部分还是潜在的益生菌。故本试验对40个人类乳样本进行分离鉴定出两株性质优异的菌株即乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9，并对其特征进行对比分析。
试验方法
试验设计
1.试验对象
从中国内蒙古自治区选取40名汉族和蒙古族健康女性，采集人类初乳样品。
2.检测方法
对样本中乳酸杆菌和双歧杆菌进行分离鉴定，并进行基因测序分析以及生理生化等特征的鉴定。
试验结果
01、乳酸菌和双歧杆菌的分离与鉴定
我们从40份人类初乳样本中共分离出197个菌株，使用BLAST进行序列分析，并使用MEGA6.0通过系统进化树构建，进行物种鉴定。其中分离出的细菌属主要以葡萄球菌(26.9%)和链球菌(37.06%)为主，其他还包括肠球菌(2.54%)、乳杆菌(5.08%)、双歧杆菌(4.06%)、丙酸杆菌(1.02%)和放线菌等（1.52%；图1）。基于乳酸杆菌和双歧杆菌菌株的益生菌特性，我们筛选出来了两种耐酸和耐胆盐性质较好的菌株，根据它们的生理生化特性和16S rRNA序列分析结果，将两个菌株分别鉴定为乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9。
图1:初乳样本中各个菌属含量详情
02、菌株的特征
菌落形态学方面，在改良的MRS琼脂培养基上可以产生直径为1-2mm的凸圆形，乳白色菌落，具有完整的边缘和光滑的表明（图2A）。革兰氏染色显示为哑铃杆菌，两端规则，有许多明显的节点（图2B）。与此同时，鼠李糖乳杆菌Probio-M9在改良的MRS琼脂培养基上可以产生直径为1-2mm的乳白色或浅黄色圆形菌落，边缘规则，中心稍高，表明不透明（图3A）。革兰氏染色为短杆菌，呈链条状（图3B）。使用扫描电子显微镜可以评估两个菌株的形态（图2C和图3C）。
图2:乳双歧杆菌Probio-M8相关形态学特征
图3:鼠李糖乳杆菌Probio-M9相关形态学特征
03、生理生化特征
这两种菌株的生理生化特征如表1和表2所示。经过初步鉴定，乳双歧杆菌Probio-M8属于双歧杆菌属，可以在空气中、pH=4.5或6.5% NaCl中生长，但不能在pH=9.6的环境下生存；乳双歧杆菌Probio-M8还可以在10-42℃的环境下生长，并有效地使用葡萄糖、乳糖、蔗糖和麦芽糖等，而对于木糖、核糖等利用效率较低。同样鼠李糖乳杆菌Probio-M9属于乳酸杆菌属，可以在空气中和pH=4.5的环境下生长，但是不能在pH=9.6或6.5% NaCl中生长；鼠李糖乳杆菌Probio-M9可以在42℃下生长，但不能在低温环境下生长，并可以有效利用葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、棉籽糖、木糖和其他碳水化合物等。
表1:乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9的生理生化特征
表2:乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9对碳水化合物的发酵
对于两种菌株的耐酸耐肠液特性，我们评估了18株乳酸杆菌和双歧杆菌在pH=2.5下的耐酸性3小时，其中有8株表现出良好的耐受性。在pH=2.5的人造胃液和pH=8.0的人造肠液中对8株菌株进行了运输耐受性测试。表3显示了乳双歧杆菌BB-12、鼠李糖乳杆菌GG和植物乳杆菌P-8以及乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9等一系列菌株在人工胃液或肠液中存活情况的对比。发现乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9表现出高耐受性（存活率大于80%）。将乳双歧杆菌Probio-M8菌株暴露在pH=2.5的人工胃液3小时（存活率85.38%）；在pH=8.0的人工肠液8小时（存活率97.25%），其存活率优于对照菌株乳双歧杆菌BB12。将鼠李糖乳杆菌Probio-M9菌株暴露在pH=2.5的人工胃液3小时（存活率83.72%）；在pH=8.0的人工肠液8小时（存活率78.33%），其存活率优于对照菌株鼠李糖乳杆菌GG。在pH=2.5的人工胃液中暴露3小时，其他6个菌株的存活率在6.52%至38.06%之间，在pH=8.0的人工肠液中暴露8小时，其存活率在1%至31.59%之间。乳双歧杆菌GSL-1和植物乳杆菌LN-3-1对人工胃液的耐受性很小。
表3:乳双歧杆菌和乳酸菌在人工胃液、人工肠液中的存活率
此外我们还对菌株胆汁盐的耐受性进行了评估（表4）。测量当每个菌株的光密度值OD(600nm)比0时的值大0.3个单位时的所需时间，也被称为滞后时间。我们发现在含0.3%胆汁盐的MRS肉汤培养基中，对照菌株和测试菌株的生长都受到了不同程度的抑制，均表现出良好的耐受性（滞后时间：Probio-M8为0.95小时、BB-12为1.98小时、Probio-M9为1.87小时、GG为2.10小时）。在0.3%胆汁盐的环境下，乳双歧杆菌Probio-M8显示出比其他两个对照菌株更强的耐受性，对胆汁盐环境的适应时间更短；而对于鼠李糖乳杆菌Probio-M9则显示出与乳双歧杆菌BB-12相似的胆汁盐耐受性，但比鼠李糖乳杆菌的耐受性要强。
表4:乳酸菌和乳双歧杆菌在0.3%胆汁盐环境下的耐受性
对于生长速率方面，我们发现将乳双歧杆菌Probio-M8(1.725x107 CFU/mL)接种到改良的MRS培养基中，在37℃下连续培养30小时，在6小时进入对数生长，在18小时活菌数达到2.075x109 CFU/mL的峰值，之后略有下降至平稳状态（图4A）。将鼠李糖乳杆菌Probio-M9(1.555x107 CFU/mL)接种到改良的MRS培养基中，在3小时至18小时期间对数生长，在21小时活菌数达到2.976x109 CFU/mL的峰值，之后略有下降至平稳状态（图4B）。
图4:乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9的生长曲线
试验结论
母乳中蕴藏着众多有益菌群，通过分离筛选我们鉴定出了乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9。通过体外耐受人工胃液和人工肠液的一系列实验发现，乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9具有良好的耐酸和耐肠液特性，可以在消化道中存活。同时发现乳双歧杆菌Probio-M8和鼠李糖乳杆菌Probio-M9对胆汁盐具有良好的耐受性，可以在适应的环境中迅速生长。
